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液相色譜常見故障及操作
  • 發(fā)布日期:2019-07-04      瀏覽次數(shù):2291
    •   【液相色譜儀系統(tǒng)】液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進樣器、柱子、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對于整個系統(tǒng)而言,柱子、泵和檢測器是核心部件同時也是易出問題的主要部位。

        常見問題及解決方法

        一、柱壓問題

        柱壓問題是使用液相色譜過程中需要密切注意的地方,柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個恒定值而是指壓力波動范圍在345kPa 以內(nèi)或在50PSI之間(在使用梯度洗脫時,柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的)。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。

        1壓力過高這是液相在使用中常見的問題,指的是壓力突然升高,

        1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時,我們應(yīng)該分段進行檢查。

        (1).首先斷開真空泵的入口處,此時PEEK管里充滿液體,使PEEK管低于溶劑瓶,看液體是否自由滴下,如果液體不滴或緩慢滴下,則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法:用30%的硝酸浸泡半個小時,在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下,溶劑過濾頭正常,在檢查;

        (2).打開Purge閥,使流動相不經(jīng)過柱子,如果壓力沒有明顯下降,則是過濾白頭堵塞。處理方法:將過濾白頭取出,用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100PSI以下,過濾白頭正常,在檢查;

        (3).把色譜柱出口端取下,如果壓力不下降,則是柱子堵塞。處理方法:如果是緩沖鹽堵塞,則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞,則要用比現(xiàn)在流動相更強的流動相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降,則可考慮將柱子的進出口反過來接在儀器上,用流動相沖洗柱子。這時,如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。問題無法解決可考慮更換色譜柱。

        2、流速設(shè)定不正確:可重新設(shè)定正確流量。

        3、流動相配比不正確:不同配比的流動相其黏度系數(shù)不相同,較高黏度的流動相相應(yīng)的系統(tǒng)壓力也大,如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設(shè)定配比。4、系統(tǒng)壓力零點漂移:調(diào)節(jié)壓力傳感器的零點。

        2壓力過低

        1、一般是由于系統(tǒng)泄漏,處理方法:尋找各個接口處,特別是色譜柱兩端的接口,把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當力擰緊或襯四氟薄膜。

        2、泵里進了空氣,但此時表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn),忽高忽低,更嚴重一點會導(dǎo)致泵無法吸上液體。處理方法:打開Purge閥,用3~5ml/min的流速沖洗,如果不行,則要用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

        3、無流動相流出:檢查儲液瓶中有無流動相,沉子是否浸在流動相中,泵是否運行。

        4、參比閥未關(guān)閉:將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0.1~0.2mL/min后關(guān)閉參比閥。

        基線問題

        1基線漂移基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題,在實際工作中,我們經(jīng)常能遇到基線漂移的情況,特別是在梯度洗脫的時候,基線漂移是常有的事。一般說來,機器剛起動時,基線容易漂移,大概要30min的平衡時間,如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽,還有就是在低波長下(220nm)平衡時間相對會比較長,但如果你在實驗過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移,則你要考慮下面的原因:

        1、柱溫波動 控制好柱子和流動相的溫度,檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。

        2、(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)控制好柱子和流動相的溫度,在檢測器之前使用熱交換器。

        3、流通池被污染或有氣體 用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池(應(yīng)斷開柱子)。如有需要,可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。

        4、紫外燈能量不足 更換新的紫外燈

        5、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。 檢查流動相的組成,使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。

        2基線噪音

        對于紫外檢測器, 氘燈光源打開后要預(yù)熱30 min以上, 基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測物無關(guān)的檢測器輸出信號的隨機擾動變化, 分短期噪聲和長期噪聲兩種。

        氘燈用的過久, 接近壽命期時( 氘燈的壽命約1 000 h) , 會使基線噪音明顯增加, 應(yīng)及時更換氘燈。除光源外, 流路中的氣泡也會產(chǎn)生噪音。對于判斷基線噪聲增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡的問題, 可將泵關(guān)上, 繼續(xù)走基線, 如果噪聲立即停止, 基線呈一條直線, 說明基線噪聲來自流動相中的氣泡, 應(yīng)設(shè)法排氣; 若停泵后仍有噪音出現(xiàn), 應(yīng)考慮是燈的問題。

        基線噪音(規(guī)則的)

        產(chǎn)生基線噪音的原因有:在流動相、檢測器或泵中有空氣;漏液;流動相混合不*;溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱);在同一條線上有其他電子設(shè)備;泵振動。

        了避免基線噪音,在正式進樣之前,需要對流動相脫氣;沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣;檢查管路接頭是否松動;泵是否漏液;是否有鹽析出和不正常的噪音,如有必要,更換泵密封;用手搖動使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器;有其他電子設(shè)備時斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正;泵振動時在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。

        基線噪音(不規(guī)則的)

        (1) 漏液:檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封,檢查流通池是否漏液。

        (2) 流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成:檢查流動相的組成。

        (3) 流動相各溶劑不相溶:選擇互溶的流動相。

        (4) 檢測器/記錄儀電子元件的問題:斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。

        (5) 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡:用強極性溶液清洗系統(tǒng);檢測器內(nèi)有氣泡,清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。

        (6) 流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音) :用硝酸清洗流通池;

        (7) 檢測器燈能量時不足更換燈;

        (8) 色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。

        (9) 流動相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,不建議使用泵的混合裝置。

        保留時間

        保留時間的漂移往往由柱老化引起,而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上,保留時間漂移的多半原因是由于不同機理的色譜柱老化,如固定相流失(例如通過水解) ,色譜柱污染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種常見的原因和解決方法如下:

        1色譜柱平衡

        如果觀察到保留時間漂移,首先應(yīng)考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。通常平衡需要10~20個柱體積的流動相,但如果在流動相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則需要相當長的時間來平衡色譜柱。流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上,從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意:水是很容易污染的流動相成分。

        2固定相穩(wěn)定性

        固定相的穩(wěn)定性都是有限的,即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用,固定相也會慢慢水解。例如,硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性好,水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩(wěn)定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解,如氨基鍵合相等。

        3色譜柱污染

        保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器,它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是:流動相本身,流動相容器,連接管、泵、進樣器和儀器密封墊,以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分,就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì),如:配藥中的賦形劑,生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物,食品樣品中的淀粉,環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量,在此情況下,保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加,可以通過使用固相提取( SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響,避免色譜柱污染簡單的方法是防患于未然。相比之下,找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑,但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物,但蛋白在THF中就不能溶解, DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

        4流動相組成

        流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等,應(yīng)防止流動相由于蒸發(fā)、反應(yīng)等等原因造成的變化。

        保留時間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個重要標志,同一種東西,兩次的保留時間相差不要超過15s,超過了半分鐘可看做保留時間漂移,就無法進行定性。

        峰型異常問題

        峰型問題是液相的主要問題,在做液相過程中,我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型,對于各種各樣的異常峰,要區(qū)別對待,從主要問題出發(fā),一個一個加以解決。

        1.色譜圖中未出峰

        系統(tǒng)未進樣或樣品分解;泵未輸液或流動相使用不正確;檢測器設(shè)置不正確;針對以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。

        2.一個峰或幾個峰是負峰

        流動相吸收本底高;進樣過程中進入空氣;樣品組分的吸收低于流動相。

        3.所有峰均為負峰

        信號電纜接反或檢測器輸出極性設(shè)置顛倒;光學(xué)裝置尚未達到平衡。

        4.所有峰均為寬峰

        系統(tǒng)未達到平衡;溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多;色譜柱尺寸及類型選擇不正確;色譜柱或保護柱被污染或柱效降低;溫度變化造成的影響。

        5.所出峰比預(yù)想的小

        樣品黏度過大;進樣品故障或進樣體積誤差;檢測器設(shè)置不正確.定量環(huán)體積不正確;檢測池污染;檢測器燈出現(xiàn)問題。

        6.出現(xiàn)雙峰或肩峰

        進樣量過大;樣品濃度過高;保護柱或色譜柱柱頭堵塞;保護拄或色譜柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。

        7.前伸峰

        進樣量或樣品濃度高,溶解樣品的溶劑較流動相極性強;保護柱或色譜柱污染或失效。

       ?、僦鶞氐停荷咧鶞?②樣品溶劑選擇不恰當:使用流動相作為樣品溶劑;③樣品過載:降低樣品含量;④色譜柱損壞:更換柱子。

        8.拖尾峰

        柱超載,降低樣品量;增加柱直徑采用較高容量的固定相;峰干擾,對樣品進行清潔過濾;調(diào)整流動相;硅羥基作用,加入三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值;柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效,更換燒結(jié)不銹鋼;加在線過濾器,對樣品進行過濾;死體積或柱外體積過大,將連接點降至低;盡可能使用內(nèi)徑較細的連接管;柱效下降,更換柱子;采用保護柱,對柱子進行再生。

        9.出現(xiàn)平頭峰

        檢測器設(shè)置不正確;進樣體積太大或樣品濃度太高。

        10.出現(xiàn)鬼峰

        進樣閥殘余峰,可能為上次樣品的殘余。在每次進完樣后用充足的時間來平衡和清洗系統(tǒng);樣品中存在未知物,改進樣品的預(yù)處理;流動相污染,更換新流動相,盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用,隔夜的流動相再次使用時要過濾;盡可能使用HPLC級試劑;流路中有小的氣泡,打開Purge閥,加大流速排除。

        11.峰分叉

       ?、俦Wo柱或分析柱污染:取下保護柱再進行分析,如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞,拆下來清洗。如果問題仍然存在,可能是柱子被強保留物質(zhì)污染,運用適當?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。②樣品溶劑不溶于流動相改變樣品溶劑,如果可能采取流動相作為樣品溶劑。

        12.峰變形

        樣品過載,減少樣品載量。

        13.早出的峰變形

        樣品溶劑選擇不恰當 ①減少進樣體積 ②運用低極性樣品溶劑

        14.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

        柱外效應(yīng) ①調(diào)整系統(tǒng)連接(使用更短、內(nèi)徑更小的管路) ②使用小體積的流通池

        15.酸性或堿性化合物的峰拖尾

        緩沖不合適①使用濃度50~100 mM的緩沖液②使用Pka等于流動相pH值的緩沖液

        16.額外的峰

        (1)樣品中有其他組分:正?,F(xiàn)象;

        (2)前一次進樣的洗脫峰:①增加運行時間或梯度斜率②提高流速;

        (3)空位或鬼峰:①檢查流動相是否純凈 ②使用流動相作為樣品溶劑 ③減少進樣體積。

       

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